Gertraud Knoll studierte von 1977 bis 1982 evangelische Theologie an der Universität Wien, nach einem Jahr als Universitätsassistentin für Systematische Theologie war sie als Vikarin in mehreren burgenländischen Gemeinden tätig. 1985 folgte ihre Amtseinführung als erste Pfarrerin der Diözese Burgenland in der Marktgemeinde Weppersdorf. Von 1994 bis 2002 war Knoll schließlich erste Superintendentin der Evangelischen Kirche A.B. in Österreich.

1998 kandidierte Gertraud Knoll als unabhängige Kandidatin für das Amt der österreichischen Bundespräsidentin und erreichte den zweiten Platz hinter Thomas Klestil. Von 2001 bis 2005 fungierte sie als vom Publikum gewählte Publikumsrätin des ORF; 2002 legte sie alle kirchlichen Ämter zurück und kandidierte für die SPÖ bei den Nationalratswahlen. 2003 übernahm Knoll die Leitung der Zukunfts- und Kulturwerkstätte.

Von 2005 bis 2007 war Gertraud Knoll Mitglied des Bundesrates, danach übernahm sie nach Caspar Einems Rückzug aus der Politik dessen Nationalratsmandat (bis 2008). Von März 2009 bis 2010 war Knoll auch Vorsitzende der SPÖ-Alsergrund. Gertraud Knoll ist mit Ferdinand Lacina verheiratet.